细胞状态差？这次可能是细胞老化

上海融禾医药     2021-12-13 14:48

大家在养细胞的时候，想必大家也一定遇到过细胞状态差这种情况，但是细胞状态差，有很多种原因造成？

细胞状态很差，常常出现的现象是：细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多（细胞凋亡后的细胞碎片）、单个细胞内有空泡（凋亡）且空泡比较多；如果细胞出现老化，也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多，此时观察到的细胞状态也是不正常的。所以，除了考虑血清和细菌污染的问题，细胞老化也不容忽视~

首先，我们要知道什么是细胞老化？

何为细胞老化？

1882年，德国生物学家Weismann曾大胆预测“在细胞水平存在老化现象”。他推测：机体的寿命限制受控于体细胞的分裂能力；在遗传进化中，不同物种的体细胞获得了不同分裂的潜能，从而决定了不同物种的寿命长短。

20世纪50年代，Swin和他的同事利用原代细胞体外培养试验证明了来源于不同物种的纤维细胞均不具备无限分裂的潜能。取得突破性进展的还是Hayflflick和Moorhead，他们做了更系统更细致的观察和描述，他们对25株人成纤维细胞进行原代培养，在这个过程中发现，经过约50次传代之后，所有细胞出现功能退化，并且丧失分裂能力的现象。此后人们将这一现象称之为“Hayflflick极限”或者自发性老化。之后也有事实证明，细胞老化并不是体外培养所导致，细胞在体内也会随着年龄的增长，逐步走向老化。

细胞老化的征兆

细胞周期阻滞

长期的细胞周期阻滞是老化细胞的基本特征，也是体外鉴定细胞老化不可或缺的指标。为了检查细胞是否跃出了细胞周期，人们通常检测增殖指示分子Ki-67的表达丰度；或者通过将与胸腺嘧啶相似的溴脱氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入到细胞培养基中，观察是否有新的DNA合成。细胞老化主要表现为G1期阻滞，个别情况下也可伴随G2/M期周期阻滞，或直接由G2/M期阻滞诱发形成。

细胞形态改变

虽然由于细胞周期的中断和DNA复制的停止，老化细胞内的DNA含量与正常细胞类似，但 RNA与蛋白质丰度均比正常细胞要明显升高。这是因为，尽管细胞进入老化阶段后蛋白质的整体合成速率降低，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，导致蛋白质在细胞内持续堆积。但，由于不同组织来源的细胞，其形态本就各不相同，因此，目前还并无客观的、统一的标准从细胞形态判断并定义老化细胞。换句话说，目前并不能直接根据细胞的形态去判断是否老化细胞。

无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现的特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。

总结

研究表明,衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化：
①细胞内水分减少,体积变小,新陈代谢速度减慢；
②细胞内酶的活性降低；
③细胞内的色素会积累；
④细胞内呼吸速度减慢,细胞核体积增大,核膜内折,染色质收缩,颜色加深.线粒体数量减少,体积增大；
⑤细胞膜通透性功能改变,使物质运输功能降低.
形态变化
总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化.衰老细胞的形态变化表现有：
1、核：增大、染色深、核内有包含物 
2、染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解 
3、质膜：粘度增加、流动性降低 
4、细胞质：色素积聚、空泡形成 
5、线粒体：数目减少、体积增大 
6、高尔基体：碎裂 
7、尼氏体：消失 
8、包含物：糖原减少、脂肪积聚 
9、核膜：内陷
分子水平的变化
1、DNA：从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制,但也有个别基因会异常激活,端粒DNA丢失,线粒体DNA特异性缺失,DNA氧化、断裂、缺失和交联,甲基化程度降低.
2、 RNA：mRNA和tRNA含量降低.
3、蛋白质：含成下降,细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应,导致蛋白质稳定性、抗原性,可消化性下降,自由基使蛋白质肽断裂,交联而变性.氨基酸由左旋变为右旋.
4、 酶分子：活性中心被氧化,金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失,酶分子的二级结构,溶解度,等电点发生改变,总的效应是酶失活.
5、脂类：不饱和脂肪酸被氧化,引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联,膜的流动性降低.如下图：

                                                                                图1 HEK293细胞  

                                                                           图2 MSC细胞

由上图可知细胞老化，出现细胞体积增大、细胞扁平。

那我们该如何防止细胞老化？

1. 不要等细胞长得太满才传代。细胞太密会导致细胞状态下降，产生细胞接触性抑制。

2. 细胞不要消化过度。采用胰蛋白酶消化细胞，会造成细胞表面一定程度的细胞损伤。

3. 最重要的是使用优质的血清和培养基：干细胞对培养基中的内毒素非常敏感。除了要留意基础培养基的内毒素外，也要留意血清的内毒素。如果血清中内毒素≥3EU/ml时，干细胞很容易老化或死亡，导致细胞“亚健康”状态，导致实验受到影响。很多使用者，在血清在试用前，就会通过提早审核该批次《检测报告》，以决定是否入围进行试用。

4. 在开始养细胞并传代时，也要特别注意冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，可以有效避免细胞损伤。